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具有高空間分辨率和力靈敏度的納米壓痕技術(shù)廣泛用于測(cè)量硬質(zhì)生物材料和組織的機(jī)械性能。然而，其分析軟生物材料和器官的可靠性尚未經(jīng)過測(cè)試。在這里，我們?cè)u(píng)估了納米壓痕測(cè)量軟生物標(biāo)本的被動(dòng)力學(xué)性能的效用。從C57BL / 6 N小鼠中收獲腎臟，肝臟，脾臟和子宮樣品。我們使用Bland-Altman圖，類內(nèi)相關(guān)系數(shù)（ICC）和受試者內(nèi)變異系數(shù)（COV）評(píng)估了生物標(biāo)本和水凝膠對(duì)照中的測(cè)試-復(fù)測(cè)試重復(fù)性。結(jié)果使用Hertzian，JKR和Oliver & Pherr模型計(jì)算得出。與水凝膠類似，所有生物標(biāo)本的Bland-Altman圖在剛度測(cè)試和復(fù)試檢查中表現(xiàn)出良好的可靠性。在所有三種模型中，ICC均大于0.8，COV小于15%。在腎臟，肝臟，脾臟和子宮中，ICC僅在Hertzian模型中始終大于0.8，而在JKR和Oliver & Pherr模型中則不然。同樣，僅在赫茲模型中腎臟、肝臟、脾臟和子宮的COV始終小于15%，而在其他模型中則不然。我們得出結(jié)論，納米壓痕技術(shù)在檢測(cè)腎臟，肝臟，脾臟和子宮的硬度方面是可行的。赫茲模型是提供所研究生物標(biāo)本離體器官剛度可靠結(jié)果的方法。
從5周，10周，20周和30周齡C57BL / 6 N小鼠解剖腎臟，肝臟和脾臟。對(duì)于腎臟和脾臟，使用每種性別和年齡的2只小鼠。對(duì)于肝臟，使用每種性別和年齡的2至4只小鼠。對(duì)于子宮，使用了八只小鼠，所有這些小鼠都在100天左右。這些實(shí)驗(yàn)得到了當(dāng)?shù)貏?dòng)物護(hù)理委員會(huì)（LAGeSo，德國柏林）和馬克斯·德爾布呂克分子醫(yī)學(xué)中心（MDC）動(dòng)物福利官員的批準(zhǔn)（編號(hào)X 9011/19）。
具有不同剛度的水凝膠（1 kPa，2 kPa，4 kPa，8 kPa，12 kPa和25 kPa）從Softwell，Matrigen，Matrigen Life Technologies，Brea，CA購買，用于質(zhì)量控制（1 kPa，2 kPa，4 kPa，8 kPa，12 kPa和25 kPa;N = 1 到 3）。
左腎和右腎分別從側(cè)中線分為兩個(gè)（圖）。3A），四個(gè)部分全部縮進(jìn)。肝臟樣本取自左葉（圖）。四A）. 整個(gè)收獲脾臟用于實(shí)驗(yàn)（圖）。4選擇并打開左子宮角（圖）。5答，B）。所有器官都經(jīng)過清潔，去除器官表面可見的血液，脂肪，膜或血管，但避免損壞它們的實(shí)質(zhì)。為了獲得平坦的表面，我們將所有樣品粘貼到直徑為6厘米的培養(yǎng)皿底部，并用蟲膠（Sigma）使外表面平整。將組織樣品浸入PBS（NaCl 4.0 M，KCl 137.0 M，Na2高原油40.01 米，千米2采購訂單40.0018米;酸堿度 7.4）。
為了確定彈性特性，我們使用了位移控制的納米壓痕儀（Piuma;光學(xué)11，荷蘭阿姆斯特丹）。該設(shè)備采用套圈頂部懸臂探頭32，33施加負(fù)載并使用基于光纖的讀數(shù)同時(shí)測(cè)量壓痕深度（圖）。1A）. 我們使用半徑為 50 μm 且懸臂剛度為 0.5 N/m 的球形探頭。在每一系列實(shí)驗(yàn)之前，通過壓入剛性表面并將懸臂彎曲等同于探頭位移來進(jìn)行懸臂彎曲校準(zhǔn)。之后，將探針聚焦在組織表面的適當(dāng)區(qū)域（圖。1B、3A、4A、5A、6B）。在25×5 μm網(wǎng)格掃描中，將每個(gè)凝膠壓痕5次（800×800個(gè)基質(zhì)），測(cè)量間隔距離為200 μm。腎臟、肝臟和脾臟樣品在9××3μm網(wǎng)格掃描中用3個(gè)壓痕（200個(gè)基質(zhì)）壓進(jìn)（圖。200B、3B、4B）。在子宮中，分別在子宮的近端、中部和遠(yuǎn)端測(cè)試了 5 × 4 μm 網(wǎng)格中具有 100 個(gè)單壓痕的三個(gè)壓痕矩陣（圖）。100B，C）。應(yīng)用的壓痕方案由在6 nm壓痕深度下4 s的加載階段（保持8000秒）和卸載階段4 s組成。所有掃描都進(jìn)行了兩次，以分析可靠性。左右腎四個(gè)部分所有結(jié)果的平均值表示為腎臟彈性。凝膠、肝臟和脾臟的硬度表示為每次掃描中所有結(jié)果的平均值。三次掃描結(jié)果的平均值作為子宮硬度。所有單個(gè)壓痕值均由 Piuma Dataviewer 版本 2.2 （Piuma;光學(xué)11，荷蘭阿姆斯特丹）。
Piuma納米壓痕技術(shù)已廣泛應(yīng)用于硬動(dòng)物器官的生物材料剛度研究，例如骨骼25、耳內(nèi)、鼻翼和鼻外隔細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì) （ECM） 水平24，26，在膝關(guān)節(jié)22，在關(guān)節(jié)軟骨中23.其他例子是人類供體角膜27、纖維化腸組織30、胰腺無細(xì)胞支架31、軟板28尤其是鈣化的動(dòng)脈瘤腹主動(dòng)脈29.該技術(shù)在測(cè)量軟生物材料，特別是離體器官的剛度方面的可行性和可靠性尚不清楚。與硬質(zhì)生物材料相比，軟質(zhì)生物材料的某些性能，如粘彈性和附著力，更容易出現(xiàn)納米壓痕的偏差。我們的研究是第一個(gè)使用這項(xiàng)技術(shù)在體外測(cè)試軟生物器官的剛度，特別是來自小鼠的剛度，這些器官廣泛用于模擬人類和動(dòng)物疾病。我們應(yīng)用了Piuma納米壓痕技術(shù)，該技術(shù)易于使用，并利用特定的探針來測(cè)量楊氏模量，以匹配組織的特定樣品特性42，43，44 .不同的組織具有不同的機(jī)械性能，因此，應(yīng)在具有某些特殊特征的組織中應(yīng)用不同的方案45.由于在實(shí)驗(yàn)前無法判斷被測(cè)樣品的特征，因此我們分析了加載和卸載零件的彈性行為檢測(cè)。除了系統(tǒng)的運(yùn)行和測(cè)量策略的開發(fā)外，組織的制備和固定也非常重要。不規(guī)則的組織無法測(cè)試，因?yàn)樵撛O(shè)備只能識(shí)別平坦穩(wěn)定的表面，并且剛度的計(jì)算會(huì)受到樣品狀況的影響。例如，如果被測(cè)表面是斜率（補(bǔ)充1，圖1A），則接觸區(qū)域不會(huì)被探頭縮進(jìn)，這意味著失去深度和力可能導(dǎo)致剛度測(cè)量錯(cuò)誤。球狀器官（補(bǔ)充1圖1B）也是不可測(cè)試的，因?yàn)樗跍y(cè)量過程中不能穩(wěn)定。此外，由于組織邊緣的障礙物，該技術(shù)不可能測(cè)試下沉的表面（補(bǔ)充1圖1C）。塊狀表面（補(bǔ)充1圖1D）不僅會(huì)影響測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性，還會(huì)導(dǎo)致探頭懸臂因卡住而損壞。一起，需要以適當(dāng)?shù)男螤詈痛笮≈苽淇蓽y(cè)試的被測(cè)組織。我們確實(shí)克服了納米壓痕技術(shù)的可行性和可靠性的這些可能限制，該技術(shù)通過使用以適當(dāng)方式解剖的孤立腎臟，肝臟，脾臟和子宮來測(cè)量軟器官硬度。我們通過對(duì)該技術(shù)與Matrigen水凝膠的比較研究證實(shí)了結(jié)果的可行性和可靠性。在給定剛度，穩(wěn)定形狀，適當(dāng)厚度和平坦表面的Matrigen水凝膠作為質(zhì)量控制，盡管它們給定的剛度不被認(rèn)為是黃金標(biāo)準(zhǔn)。然而，我們的Bland-Altman圖、ICC和COV證明了所用凝膠的良好可靠性。因此，我們得出結(jié)論，納米壓痕技術(shù)在我們的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和這種材料上運(yùn)行良好且可靠。
接下來，我們測(cè)試了該技術(shù)在體外測(cè)量四個(gè)器官的硬度，即腎臟，肝臟，脾臟和子宮。盡管Bland-Altman圖沒有給我們提供許多不合格的結(jié)果，但不同模型中四種器官硬度的結(jié)果的可靠性只能通過比較ICC和COV來驗(yàn)證。在四個(gè)器官中，所有赫茲模型的結(jié)果都遵循ICC的量化標(biāo)準(zhǔn)，COVs顯示出可靠的結(jié)果。JKR或Oliver & Pharr模型的結(jié)果并不總是符合高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。觀察到差異的原因可能取決于樣品在卸載狀態(tài)下的粘性差異。
例如，在JKR模型中，即使在相同的樣品上，一些斑點(diǎn)是粘性的，而一些單個(gè)壓痕顯示沒有粘附，如圖所示。1E，這將增加測(cè)試和重新測(cè)試之間的差異。因此，我們的結(jié)果表明，在強(qiáng)制壓痕下，最好使用赫茲模型計(jì)算所研究的四個(gè)器官的硬度。值得注意的是，該模型已被其他研究人員使用，他們?cè)谘芯恐欣昧思{米壓痕技術(shù)。27，28，29 ，而其他研究沒有報(bào)告使用的模型30，31.此外，將子宮與其他三個(gè)器官的結(jié)果進(jìn)行比較，我們發(fā)現(xiàn)即使在赫茲模式下，根據(jù)Eff計(jì)算硬度的情況下子宮的COV值為11.6893%，在根據(jù)E計(jì)算剛度的情況下，子宮的COV值為14.1841%，非常接近閾值，遠(yuǎn)高于赫茲模型中其他三個(gè)器官的COV值。這表明重復(fù)測(cè)量子宮之間的差異大于肝臟，腎臟和脾臟的變異性。一個(gè)可能的原因是子宮比其他三個(gè)器官更小更薄，在實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)更小更薄的器官子宮的邊緣更容易卷起，導(dǎo)致類似情況如補(bǔ)充1圖1B所示，預(yù)計(jì)會(huì)影響測(cè)量結(jié)果。因此，該方法在體外較大較厚的軟器官中的可靠性較好。
此外，納米壓痕的成功應(yīng)用在很大程度上取決于材料特征，例如被測(cè)組織的形狀;測(cè)量具有復(fù)雜粗糙表面的生物材料往往很困難。當(dāng)一個(gè)組織被手工轉(zhuǎn)化為可以測(cè)試的材料時(shí)，不知道它的彈性是否保持與原始器官的彈性相同的性質(zhì)，以及器官的部分彈性是否可以代表其整體彈性。因此，對(duì)于某些器官研究，體內(nèi)測(cè)試可能是提供器官機(jī)械性能詳細(xì)見解的更好甚至的選擇。然而，體內(nèi)測(cè)試在測(cè)量過程中可能會(huì)受到其他因素的干擾和影響，因此納米壓痕器可以直接與目標(biāo)材料接觸進(jìn)行測(cè)量可能是一個(gè)優(yōu)勢(shì)。目前，該技術(shù)的應(yīng)用存在較多的局限性和不足。例如，其有效性和真實(shí)性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，生物材料納米壓痕的標(biāo)準(zhǔn)化程序尚未建立。因此，我們不能肯定它是否會(huì)成為軟器官和組織機(jī)械生物學(xué)和生物力學(xué)研究中的工具。然而，隨著這項(xiàng)技術(shù)的研發(fā)越來越深入，我們預(yù)計(jì)它將有很大的機(jī)會(huì)應(yīng)用于軟器官生理學(xué)和病理學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的研究。
Piuma納米壓痕技術(shù)是一種簡單可行的離體器官硬度測(cè)試方法，如腎臟，肝臟，脾臟和子宮。在表面無序的小而薄的組織中，我們預(yù)計(jì)結(jié)果的變化會(huì)增加。赫茲模型是體外測(cè)量軟器官和生物材料的被動(dòng)力學(xué)性能的方法。JKR和Oliver & Pharr模型沒有提供可靠的結(jié)果。
原文鏈接：評(píng)估納米壓痕在軟生物材料硬度測(cè)量中的應(yīng)用：腎臟、肝臟、脾臟和子宮 |科學(xué)報(bào)告
Piuma是功能強(qiáng)大的臺(tái)式儀器，可探索水凝膠、生理組織和生物工程材料的微觀機(jī)械特性。表征尺度從宏觀直至細(xì)胞。專為分析測(cè)試軟材料而設(shè)計(jì)，測(cè)量復(fù)雜和不規(guī)則材料在生理?xiàng)l件下的力學(xué)性能。杭州軒轅科技有限公司
● 內(nèi)置攝像鏡頭，方便實(shí)時(shí)觀察樣品臺(tái)
● 實(shí)時(shí)分析計(jì)算測(cè)量結(jié)果，原始數(shù)據(jù)并將以文本文件存儲(chǔ)，方便任何時(shí)候?qū)隓ataviewer軟件進(jìn)行復(fù)雜處理
● 探針經(jīng)過預(yù)先校準(zhǔn)，即插即用。對(duì)于時(shí)間敏感的樣品確保了快速測(cè)量
● 光纖干涉MEMS技術(shù)能夠以無損的方式測(cè)量即使是最軟的材料，并保證分辨率。同時(shí)探針可以重復(fù)使用Piuma軒轅納米壓痕儀Piuma軒轅納米壓痕儀
| 模量測(cè)試范圍 | 5 Pa - 1 GPa |
| 探頭懸臂剛度 | 0.025 - 200 N/m |
| 探頭尺寸(半徑) | 3 - 250 μm |
| 最大壓痕深度 | 100 μm |
| 傳感器最大容量 | 200 |
| 測(cè)試環(huán)境 | air, liquid (buffer/medium) |
| 粗調(diào)行程 | X*Y：12×12 mm Z：12 mm |
加載模式 | Displacement / Load* / Indentation* |
| 測(cè)試類型 | 準(zhǔn)靜態(tài)(單點(diǎn)，矩陣) 蠕變，應(yīng)力松弛 DMA動(dòng)態(tài)掃描 (E', E'', tanδ) |
| 動(dòng)態(tài)掃描頻率* | 0.1 - 10 Hz |
| 內(nèi)置擬合模型 | Young's Modulus (Hertz / Oliver-Pharr / JKR) |
| *為可選升級(jí)配置 | |
新型光纖干涉式懸臂梁探頭，利用干涉儀來監(jiān)測(cè)懸臂梁形變。
創(chuàng)新型光纖探頭，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)納米壓痕儀無法測(cè)試軟物質(zhì)的問題，也解決了AFM在力學(xué)測(cè)試中的波動(dòng)大，操作困難、制樣嚴(yán)苛等常見缺陷。
● 背景噪音低：激光干涉儀抗干擾強(qiáng)于AFM反射光路
● 制樣更簡單：對(duì)樣品的粗糙度寬容度高于AFM
● 剛度選擇更準(zhǔn)確：平行懸臂梁結(jié)構(gòu)有利于準(zhǔn)確判別壓痕深度與壓電陶瓷位移比例關(guān)系，便于選擇合適剛度探頭來保證彈性形變關(guān)系的穩(wěn)定性，進(jìn)而獲得重復(fù)率更高、準(zhǔn)確性更好的數(shù)據(jù)
● 借助功能強(qiáng)大而易于操作的軟件，用戶可以自由控制壓痕程序（載荷、位移等）。自動(dòng)處理曲線的流程，可以獲得數(shù)據(jù)和結(jié)果的快速分析
● 原始參數(shù)完整txt導(dǎo)出，便于后續(xù)復(fù)雜處理的需要
● 利用Hertz接觸模型從加載部分計(jì)算彈性模量，與常用的Oliver&Pharr方法相比，更為適合生物組織和軟物質(zhì)材料特性
| 年 份 | 期 刊 | 題 目 |
|---|---|---|
| 2022 | Advanced Functional Materials | Engineering Vascular Self-Assembly by Controlled 3D-Printed Cell Placement |
| 2022 | Biomaterials | Hydrogels derived from decellularized liver tissue support the growth and differentiation of cholangiocyte organoids |
| 2021 | Biofabrication | 3D bioprinting of tissue units with mesenchymal stem cells, retaining their proliferative and differentiating potential, in polyphosphate-containing bio-ink |
| 2021 | nature communications | Janus 3D printed dynamic scaffolds for nanovibration-driven bone regeneration |
| 2020 | Environmental Science & Technology | Effect of Nonphosphorus Corrosion Inhibitors on Biofilm Pore Structure and Mechanical Properties |
| 2020 | Acta Biomaterialia | A multilayer micromechanical elastic modulus measuring method in ex vivo human aneurysmal abdominal aortas |
