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一、背景
呼吸機(jī)引起的肺損傷 （VILI） 是急性肺損傷 （ALI） 或急性呼吸窘迫綜合征 （ARDS） 患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。雖然p120是調(diào)節(jié)細(xì)胞連接的重要蛋白質(zhì)，但應(yīng)探索預(yù)防和治療VILI的進(jìn)一步機(jī)制。
二、方法
用p12小干擾（si）RNA，p120 cDNA，野生型E-鈣粘蛋白并列膜結(jié)構(gòu)域或K120R突變并列膜結(jié)構(gòu)域（K83R-JMD）轉(zhuǎn)染的小鼠肺上皮細(xì)胞（MLE-83）進(jìn)行20%循環(huán)拉伸2或4小時(shí)。此外，用c-Src抑制劑PP預(yù)處理的MLE-12細(xì)胞和小鼠2或RhoA抑制劑Y27632，分別經(jīng)歷20%的循環(huán)拉伸或機(jī)械拉伸。此外，野生型C57BL / 6小鼠在機(jī)械通氣前轉(zhuǎn)染p120 siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。然后分析細(xì)胞裂解物和肺組織以檢測(cè)肺損傷。
三、結(jié)果
20%活性c-Src的循環(huán)拉伸，誘導(dǎo)E-鈣粘蛋白，p120和封閉素的降解。然而，p120的缺失增加了E-鈣粘蛋白的降解和內(nèi)吞作用。免疫沉淀和免疫熒光結(jié)果顯示p120和E-鈣粘蛋白之間的關(guān)聯(lián)降低，而p120 siRNA和K83R-JMD組在20%循環(huán)拉伸后間隙形成增加。p120的缺失還降低了閉塞素水平，并通過(guò)增強(qiáng)RhoA活性降低了閉塞素和ZO-1的關(guān)聯(lián)。然而，封閉素和E-鈣粘蛋白水平的改變被PP逆轉(zhuǎn)2或Y27632處理與循環(huán)拉伸組相比。一致地，p120過(guò)表達(dá)組在20%循環(huán)拉伸后，連接蛋白的表達(dá)、再分布和解離均恢復(fù)。此外，p120在機(jī)械通氣下通過(guò)增加濕/干稱重比和增加p120耗盡小鼠細(xì)胞因子（腫瘤壞死因子-α和白細(xì)胞介素-六）的產(chǎn)生來(lái)證實(shí)p<>在VILI中的作用。
細(xì)胞機(jī)械循環(huán)拉伸
圖1
環(huán)狀拉伸對(duì)粘附連接蛋白和緊密連接蛋白的影響。將柔性細(xì)胞板上的MLE-12細(xì)胞單層經(jīng)受20%循環(huán)拉伸2或4小時(shí)。 （a）蛋白質(zhì)印跡顯示p120，E-鈣粘蛋白和封閉素在循環(huán)拉伸后減少。（b） 提取膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白。通過(guò)蛋白質(zhì)印跡測(cè)定E-鈣粘蛋白在膜和細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)。周期性拉伸可誘導(dǎo)E-鈣粘蛋白內(nèi)吞作用。（c）免疫熒光染色和定量數(shù)據(jù)顯示p120和E-鈣粘蛋白在循環(huán)拉伸下結(jié)合。固定MLE-12細(xì)胞并用抗p120和抗E-鈣粘蛋白染色，然后用Alexa偶聯(lián)的二抗染色。（d）肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑是通過(guò)用德克薩斯紅偶聯(lián)鬼筆環(huán)肽（紅色）進(jìn)行免疫熒光染色來(lái)確定的。由循環(huán)拉伸引起的細(xì)胞間隙用箭頭標(biāo)記。細(xì)胞核（藍(lán)色）用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。比例尺 = 10 μm。*p < 0.05 與對(duì)照組相比，+p < 0.05 與 CS 2 h 組相比。實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次
四、結(jié)論
p120通過(guò)調(diào)節(jié)粘附和緊密連接來(lái)防止VILI。p120通過(guò)增加p120與E-鈣粘蛋白的并列膜結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)聯(lián)來(lái)抑制E-鈣粘蛋白內(nèi)吞作用。此外，p120通過(guò)抑制RhoA活性來(lái)減少閉塞素的降解。這些發(fā)現(xiàn)說(shuō)明了p120預(yù)防VILI的進(jìn)一步機(jī)制，特別是對(duì)于ALI或ARDS患者。
技術(shù)背景：
當(dāng)前細(xì)胞基礎(chǔ)研究以二維靜態(tài)培養(yǎng)為主，這種平面培養(yǎng)與實(shí)際“動(dòng)態(tài)+立體"模式差別很大，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞分化、細(xì)胞間相互作用與體內(nèi)動(dòng)態(tài)環(huán)境產(chǎn)生明顯差異。比如細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞形態(tài)以及基因蛋白表達(dá)改變等。
●動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前更可靠的評(píng)估
●干細(xì)胞分化機(jī)制
●機(jī)械刺激力與癌癥的相關(guān)性
●生醫(yī)材料與細(xì)胞動(dòng)態(tài)特性研究
●體外疾病微環(huán)境的快速建立
CELL TANK為細(xì)胞和組織模型提供機(jī)械拉伸條件的平臺(tái)。
CELL TANK為細(xì)胞牽張系統(tǒng)使科學(xué)家能夠輕松而精確地將仿生機(jī)械應(yīng)變應(yīng)用于細(xì)胞和組織。國(guó)產(chǎn)細(xì)胞循環(huán)拉伸設(shè)備國(guó)產(chǎn)細(xì)胞循環(huán)拉伸設(shè)備
拉伸腔體共有三款 分別為32*32mm；20*20mm；10*10mm
細(xì)胞應(yīng)力加載培養(yǎng)系統(tǒng)
2. 細(xì)胞增殖后，選擇拉伸模式并開(kāi)始循環(huán)刺激。
3. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)收獲/處理細(xì)胞，分析數(shù)據(jù)。
· 均勻負(fù)載
培養(yǎng)腔室采用預(yù)埋橫桿技術(shù)，保證每個(gè)細(xì)胞都沿著拉伸軸均勻地承受應(yīng)變，非軸向方向上的次級(jí)載荷極低
· 高再現(xiàn)性
高精度步進(jìn)電機(jī)保證在各種速度和拉伸比組合中實(shí)現(xiàn)一致的運(yùn)動(dòng)程序，機(jī)械穩(wěn)定性與拉伸膜的*彈性相結(jié)合，保證高度可重復(fù)的力學(xué)刺激
· 一體式控制
自帶觸摸控制屏，無(wú)需電腦。內(nèi)置ARM芯片，高效穩(wěn)定運(yùn)行的同時(shí)簡(jiǎn)單易用
· 多樣的拉伸模式
靈活配置不同牽張加載周期、大小、頻率、持續(xù)時(shí)間，靜態(tài)保持、正弦波形、三角波形、矩形以及各種特制波形
· 高通量培養(yǎng)腔室
有效拉伸面積32×32mm，PDMS材質(zhì)基底適配各種實(shí)驗(yàn)室分析技術(shù)，包括細(xì)胞固定和熒光成像等
| 外形尺寸 350x330x110 mm | |
| 主機(jī)重量 3 kg | |
| 拉伸腔體 4個(gè)，32x32 mm / 8個(gè)，20x20 mm | |
| 控制模式 三角波、正弦波、方波及其組合 | |
| 最大應(yīng)變率 30% | |
| 最高拉伸速率 30 mm/s | |
| 最高循環(huán)頻率 2 Hz | |
| 基底膜厚度 0.2 mm | |
| 使用環(huán)境 CO2培養(yǎng)箱 |
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