一、前言
面部創(chuàng)傷(例如嚴(yán)重?zé)齻┗蚰[瘤切除術(shù)后耳鼻的重建可能具有挑戰(zhàn)性,特別是當(dāng)軟骨框架受損時(shí)。然后,自體軟骨移植物通常與皮瓣聯(lián)合使用,例如鼻子的前額皮瓣或耳朵的脾氣膜筋膜瓣。然而,軟骨移植物的供體部位可能有限,并且總是存在一定量的供體部位發(fā)病率。1特別是,軟骨結(jié)構(gòu)(如耳朵或鼻翼)的重建仍然是一個(gè)挑戰(zhàn),因?yàn)樗鼈儚?fù)雜的三維形狀和對(duì)軟骨特征的高要求。2軟骨結(jié)構(gòu)的彈性特性不僅與臨床結(jié)果相關(guān),而且與更基礎(chǔ)的研究有關(guān)。
從臨床醫(yī)生的角度來(lái)看,人們傾向于關(guān)注移植組織的大規(guī)模力學(xué)。為了確定這一點(diǎn),通常執(zhí)行粗機(jī)械測(cè)試。例如,由Britt等人測(cè)量耳軟骨和組織工程軟骨的拉伸性能。3通過(guò)將增量拉伸載荷施加到啞鈴形的軟骨切口上。羅伊等人提出了另一種方法4誰(shuí)比較了安裝在機(jī)械光譜儀中的3點(diǎn)彎曲裝置中的天然,工程耳骨和肋軟骨。壓縮載荷實(shí)驗(yàn)通常由受限壓縮或壓痕組成。5,6拉伸或壓縮測(cè)量都有其優(yōu)點(diǎn)和局限性。7然而,它們都有一個(gè)關(guān)鍵的局限性,即上述方法僅提供總解剖學(xué)尺度上的信息。目前,許多研究小組正在探索不同面部組織的再生醫(yī)學(xué)和組織工程的可能性。例如,組織工程耳軟骨可能是克服組織移植問(wèn)題的一種選擇,例如供體部位的發(fā)病率。8從手術(shù)的角度來(lái)看,上述機(jī)械測(cè)試很重要,因?yàn)槲覀冃枰銐驈?qiáng)度的材料,以便在覆蓋肌肉和皮膚時(shí)保持形狀。然而,為了設(shè)計(jì)用于(軟骨)組織再生的適當(dāng)支架,關(guān)于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)水平的更詳細(xì)的機(jī)械信息至關(guān)重要。
組織工程的關(guān)鍵是為再生細(xì)胞保持其表型并形成新組織創(chuàng)造適當(dāng)?shù)沫h(huán)境。ECM是組織形式和功能的基礎(chǔ)。9耳軟骨ECM由膠原束,彈性蛋白纖維和糖胺聚糖的復(fù)雜混合物組成,每種都對(duì)組織的機(jī)械性能具有特定的影響。越來(lái)越多的證據(jù)表明,細(xì)胞非常容易受到其環(huán)境的機(jī)械特性的影響。10,11因此,支架的剛度對(duì)細(xì)胞行為和命運(yùn)有重要影響。12–14從而在結(jié)構(gòu)作為一個(gè)整體的機(jī)械特性上。為了形成正確的組織,支架必須與受損組織的原始硬度緊密匹配。因此,關(guān)于微尺度ECM生物力學(xué)的特定空間信息對(duì)于臨床成功至關(guān)重要;隨著時(shí)間的推移,我們需要能夠在細(xì)胞(微觀)水平上監(jiān)測(cè)組織工程結(jié)構(gòu)的機(jī)械性能。再生軟骨將隨著新的ECM組件和結(jié)構(gòu)的發(fā)展而發(fā)生機(jī)械變化,支架退化并被替換。因此,在原子力顯微鏡(AFM)和大機(jī)械測(cè)試之間,在微觀尺度上對(duì)組織工程和移植結(jié)構(gòu)的質(zhì)量評(píng)估對(duì)于再生醫(yī)學(xué)的未來(lái)臨床實(shí)施至關(guān)重要。為了解決這個(gè)問(wèn)題,我們測(cè)試了一種商用壓痕器件(Piuma Nanoindenter;Optics11,荷蘭阿姆斯特丹)能夠在適當(dāng)?shù)奈⒊叨壬线M(jìn)行測(cè)量。該系統(tǒng)基于套圈頂懸臂探頭12其在生命科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用已經(jīng)在不同領(lǐng)域得到證明。13,14在這里,我們擴(kuò)展了這一系列研究,以評(píng)估其使用反向組織工程模型監(jiān)測(cè)耳軟骨再生隨時(shí)間變化的適用性。
軟骨對(duì)機(jī)械力的響應(yīng)受2種機(jī)制的影響:流體動(dòng)力學(xué)和ECM結(jié)構(gòu)本身的變化。5糖胺聚糖通過(guò)吸引水分和使?jié)B透壓積聚而形成ECM的重要組成部分。15彈性蛋白纖維的分布和機(jī)械功能是耳軟骨所有的。16它們對(duì)耳朵特定機(jī)械性能的貢獻(xiàn)使得在植入工程軟骨時(shí),它們已經(jīng)充分形成至關(guān)重要。相反,去除這些成分中的任何一個(gè)都會(huì)定性地影響軟骨。我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)耳軟骨組織模型,以反向方式模擬支架隨時(shí)間推移的發(fā)展。通過(guò)對(duì)這些組分中的任何一種進(jìn)行特定的酶降解,我們創(chuàng)建了一個(gè)客觀的研究模型,以測(cè)試壓頭是否能夠在非破壞性物質(zhì)中以適當(dāng)?shù)某叨葴?zhǔn)確測(cè)量ECM的各種結(jié)構(gòu)組分之間的差異。隨著人們的廣泛關(guān)注和最近的進(jìn)展,例如用于組織再生的3維生物打印機(jī),從頭到尾監(jiān)測(cè)發(fā)育組織的機(jī)械質(zhì)量的能力對(duì)于在臨床上實(shí)施這些新型組織工程方法至關(guān)重要。
二、方法
(1)樣品制備
耳軟骨是在附近屠宰場(chǎng)從2至3歲的荷蘭奶山羊單側(cè)獲得的。耳朵(n = 9)被運(yùn)送到冰上的實(shí)驗(yàn)室,在那里±2厘米2從每個(gè)耳朵的基部取出大小大小的軟骨樣本。將樣品進(jìn)一步橫向分成三個(gè)5mm高的部分,并用一層薄薄的氰基丙烯酸酯(超級(jí))膠水固定在玻璃顯微鏡載玻片上。新鮮測(cè)量每個(gè)耳樣品的橫向平面,然后將相同的樣品在37°C的磷酸鹽緩沖鹽水中孵育,以便在24和48小時(shí)測(cè)量。其他2個(gè)樣品以類似的孵育方式進(jìn)行,但分別加入1%的透明質(zhì)酸酶或彈性蛋白酶溶液(均來(lái)自密蘇里州圣路易斯的Sigma Aldrich)以除去糖胺聚糖或彈性蛋白。
(2)縮進(jìn)設(shè)置
使用商用納米壓痕儀(Piuma;光學(xué)11)。該儀器能夠通過(guò)壓痕局部測(cè)定樣品在空氣和液體環(huán)境中的機(jī)械性能。它采用套圈頂懸臂探頭8,22施加負(fù)載,同時(shí)使用基于光纖的讀數(shù)測(cè)量壓痕深度。由此產(chǎn)生的應(yīng)力-應(yīng)變曲線(圖.(圖1A)1A)使用Oliver和Pharr描述的模型進(jìn)行分析17,23用于球形壓頭,以確定有效的楊氏模量 (E*)。使用合適的探頭進(jìn)行設(shè)置,能夠施加0.1至7.5 μN(yùn)的力。在每個(gè)系列實(shí)驗(yàn)之前,通過(guò)縮進(jìn)剛性表面并將懸臂彎曲等同于探頭位移來(lái)執(zhí)行懸臂彎曲校準(zhǔn)。在許多方面,這種設(shè)置可與AFM相媲美。然而,與大多數(shù)通常在亞細(xì)胞(納米)范圍內(nèi)起作用的AFM相反,這種設(shè)置也能夠在細(xì)胞和組織范圍內(nèi)發(fā)揮作用。
(3)壓痕探頭
使用直徑為78μm,剛度為80 N /m的球形壓頭來(lái)接觸面積,并將壓痕過(guò)程中的組織損傷降至(圖.(圖1B)。1B).為了進(jìn)一步增加與的接觸面積,通過(guò)使用設(shè)置的全壓痕深度(20μm)使壓痕深度。
(4)縮進(jìn)協(xié)議
壓痕協(xié)議經(jīng)過(guò)精心優(yōu)化,以最大限度地減少影響測(cè)量的粘彈性效應(yīng)。使用2秒加載周期,2秒保持期和4秒卸載周期,可以精確確定曲線角系數(shù)。
(5)壓痕實(shí)驗(yàn)
在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將樣品浸沒(méi)在磷酸鹽緩沖鹽水中,以防止脫水并最大限度地減少壓頭和組織表面之間的粘合力。在準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)(未顯示數(shù)據(jù))中,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)膠水對(duì)負(fù)載的不利影響。每個(gè)樣品都沿著軟骨的中心線縮進(jìn),以避免邊緣效應(yīng)。為了平均手術(shù)切口和組織不均勻性可能的表面粗糙度效應(yīng),將每個(gè)樣品縮進(jìn)在相距300μm的9個(gè)位置以獲得平均數(shù)據(jù)。
(6)組織學(xué)
將三個(gè)樣品固定在4%福爾馬林中,并嵌入石蠟中,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行切片。載玻片用Alcian藍(lán)色或Lawson染色分別描繪糖胺聚糖或彈性蛋白纖維,并拍攝顯微圖像(徠卡DM4000B / DC500;韋茨拉爾, 德國(guó);放大倍率,200×)。
(7)統(tǒng)計(jì)分析
在降解實(shí)驗(yàn)之前,通過(guò)對(duì)3個(gè)不同耳軟骨樣品的單一位置進(jìn)行10次連續(xù)測(cè)量的類內(nèi)相關(guān)系數(shù)(雙向隨機(jī)效應(yīng))來(lái)確定壓痕的再現(xiàn)性。使用類間相關(guān)系數(shù)(ICC)計(jì)算降解實(shí)驗(yàn)中單個(gè)樣品上單獨(dú)壓痕之間的變異性?;谶@些結(jié)果,通過(guò)方差檢驗(yàn)的單變量分析確定了有效楊氏模量的差異。所有分析均使用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件版本22進(jìn)行。P值小于0.05被認(rèn)為是顯著的。
三、結(jié)果
這些實(shí)驗(yàn)的一個(gè)重要方面是壓痕協(xié)議的定義,以確保粘彈性效應(yīng)既不影響也不影響卸載曲線。粘彈性效應(yīng)表現(xiàn)為壓痕過(guò)程中能量的時(shí)間依賴性耗散。18這在應(yīng)力-應(yīng)變曲線中通過(guò)加載曲線和卸載曲線之間的面積進(jìn)行可視化。奧利弗和法爾描述的模型17利用卸載曲線的斜率來(lái)確定有效的楊氏模量(圖.(圖 1A)。1為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn),在加載后引入保持期,以使樣品有足夠的時(shí)間在卸載樣品之前使能量消散。除此之外,卸載速度保持足夠慢,以使樣品能夠重新調(diào)整到不斷減小的負(fù)載,因?yàn)檠舆t樣品響應(yīng)的累積會(huì)對(duì)卸載曲線產(chǎn)生不利影響。準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)(數(shù)據(jù)未顯示)表明,2秒負(fù)載,2秒保持和4秒卸載周期足以防止粘彈性效應(yīng)顯著影響卸載曲線(負(fù)載值線性下降,從而可以精確確定曲線角度系數(shù);圖)。圖1A)。1A).雖然樣品在壓痕深度方面在保持期后仍表現(xiàn)出松弛,但較長(zhǎng)的保持期并不表明在*壓痕期間能量耗散的顯著變化。探針直徑的選擇基于組織學(xué)切片,顯示平均山羊耳狀軟骨細(xì)胞直徑約為10μm,而含有2或3個(gè)軟骨細(xì)胞的更橢圓形的腔隙最長(zhǎng)測(cè)量在40μm左右(圖。(圖 2)。2).因此,78μm被認(rèn)為足以測(cè)量平均ECM值,同時(shí)仍然足夠精細(xì)以提供詳細(xì)信息。文獻(xiàn)中的力學(xué)測(cè)試顯示,耳軟骨的楊氏模量范圍為0.8至8 MPa。16以此為參考,選擇了剛度為80 N / m的懸臂,以確保探頭的大部分行程將轉(zhuǎn)化為壓痕深度而不是懸臂彎曲,從而產(chǎn)生7至15μm之間的壓痕深度。
通過(guò)在3個(gè)不同樣品上的單個(gè)點(diǎn)重復(fù)壓痕來(lái)確認(rèn)壓痕系統(tǒng)的可重復(fù)性,ICC為0.99。組織學(xué)證實(shí)了糖胺聚糖和彈性蛋白從進(jìn)行壓痕實(shí)驗(yàn)的外圍區(qū)域的處理組織樣品中降解(圖。(圖3)3).
每個(gè)樣品的不同測(cè)量結(jié)果具有良好的再現(xiàn)性,ICC平均值為0.9(0.81-0.98)。發(fā)現(xiàn)耳軟骨有效楊氏模量的本地值為5.2 MPa(±0.7)。透明質(zhì)酸酶治療24和48小時(shí)后,這些值分別降至2.2 MPa(±0.6)和2.0 MPa(±0.3)。特別是在彈性蛋白酶組中,個(gè)體差異差異很大,24小時(shí)時(shí)平均有效楊氏模量為4.2 MPa(±0.62),48小時(shí)后平均有效楊氏模量為3.0 MPa(±0.44)(圖。(圖 4)。4).對(duì)照組的加班時(shí)間也略有下降,可能是由于自溶過(guò)程,但48小時(shí)后所有治療組之間均觀察到穩(wěn)定且顯著的差異(P <0.001)(圖5)5).
四、討論
當(dāng)臨床醫(yī)生想到組織工程時(shí),他們往往傾向于只關(guān)注總機(jī)械性能的最終結(jié)果,因?yàn)閺呐R床角度來(lái)看,這一方面對(duì)手術(shù)成功至關(guān)重要。然而,現(xiàn)在人們?cè)絹?lái)越認(rèn)識(shí)到,許多組織工程植入物由于細(xì)胞的異常行為導(dǎo)致鈣化或變形和再吸收而長(zhǎng)期失敗。19優(yōu)化細(xì)胞將遇到的生物力學(xué)環(huán)境可能是指導(dǎo)細(xì)胞分化和基質(zhì)生產(chǎn)質(zhì)量的關(guān)鍵。測(cè)量Young組織和支架模量的細(xì)微差異的能力對(duì)于正確微調(diào)細(xì)胞生物力學(xué)微環(huán)境至關(guān)重要。在這項(xiàng)研究中,我們研究了一種能夠在細(xì)胞水平上測(cè)量組織硬度的新工具,該工具不僅可以對(duì)發(fā)育組織和構(gòu)建體的最終特征進(jìn)行無(wú)損評(píng)估,還可以對(duì)發(fā)育中的組織和構(gòu)建體的起始條件和過(guò)程質(zhì)量進(jìn)行無(wú)損評(píng)估,從而促進(jìn)新型,有效的組織工程方法的開(kāi)發(fā)。
我們選擇了“反向組織工程模型",使用山羊耳朵軟骨作為新鮮材料的一致來(lái)源,以證明這項(xiàng)新技術(shù)在測(cè)量各種組合物中的組織彈性的適用性。為了探索我們的設(shè)置的適用性和靈敏度,以檢測(cè)組織(再)生成過(guò)程中組織(再)生成過(guò)程中ECM質(zhì)量和組成的細(xì)微差異,以組織剛度為結(jié)果參數(shù),我們用不同的降解酶處理成熟的彈性軟骨。彈性蛋白或糖胺聚糖的去除導(dǎo)致彈性的顯著普遍降低。然而,彈性蛋白酶消化組的巨大差異令人驚訝。史密斯等人20已經(jīng)注意到,它們?cè)谧甸g盤(pán)環(huán)纖維中酶促降解彈性纖維的廣泛方案不是絕對(duì)的。特別是在彈性蛋白酶組中,他們報(bào)告了高變異性。他們進(jìn)一步提出,彈性纖維的降解會(huì)導(dǎo)致膠原結(jié)構(gòu)的分離和變形。這可以解釋為什么我們?cè)趶椥缘鞍酌附M中發(fā)現(xiàn)了如此大的品種;換句話說(shuō),這可能是由于彈性蛋白濃度的變化和隨后動(dòng)物之間的降解以及剩余膠原基質(zhì)的重排。后者也可以解釋一些樣品的彈性最初略有增加。在一項(xiàng)關(guān)于彈性蛋白酶對(duì)豬肉色動(dòng)脈壁的影響的研究中也觀察到了這種效應(yīng)。21彈性蛋白酶降解與動(dòng)脈壁腫大有關(guān),但與硬化或軟化無(wú)關(guān)。彈性蛋白纖維改變后ECM的結(jié)構(gòu)變化也被提出是耳朵隨著年齡增長(zhǎng)而增大的原因。22
總之,確定(亞)細(xì)胞水平上的機(jī)械性質(zhì)對(duì)于深入了解細(xì)胞外力學(xué)的優(yōu)化至關(guān)重要。我們使用的光機(jī)械傳感器系統(tǒng)提供了一種快速可靠的方法來(lái)測(cè)量該水平上的軟骨ECM變化。目前,我們正在探索將壓痕系統(tǒng)與光學(xué)相干斷層掃描相結(jié)合的可能性,這將允許在縮進(jìn)時(shí)同時(shí)可視化組織結(jié)構(gòu)。因此,可以以無(wú)創(chuàng)方式辨別不同組織層的硬度。將來(lái),這可能為我們提供一種重要的臨床工具,以確定面部重建中移植或再生組織的質(zhì)量。